Crioconservarea unor celule umane, în funcție de dorința și nevoile posesorului, a ieșit de mult din universul SF, devenind practică uzuală în medicină.
Că e vorba de celulele stem de la nou-născuți, de spermă, ovocite, țesut ovarian sau embrioni, crioconceservarea și-a dovedit fezabilitatea și utilitatea.
Congelare și vitrificare
Congelarea definește procesul de transformare a produsului dintr-o fază lichid în faza solidă cu pierdere de căldură. În acest proces se pot forma cristale de gheață. Procesul invers este reprezentat de decongelare.
Vitrificarea reprezintă procesul de solidificare din stare lichidă într-o stare foarte asemănătoare sticlei, fără formare de cristale de gheață. Inversul virtificării este încălzirea.
Principiul crioprezervării
Se bazează pe osmoza și pe abilitatea apei de a difuza prin membrana celulară, membrană permeabilă pentru agenții crioprotectivi.
Cele două posibilități pentru crioconservare sunt:
– congelarea treptată – temperatura coboară și apa cristalizeaza în afara celulei. Are loc o difuziune osmotică a apei din celule în spatiul extracelular.
– vitrificarea – soluția este răcită rapid, ceea ce previne formarea cristalelor de gheață. Starea „glass like” este formată la temperatură foarte scăzută.
Protecția celulelor crioconservate
Celulele supuse crioconservării sunt apărate de distrugere cu două categorii de subtanțe crioprotectante.
Scopul criptotectantului este de minimiza leziunile pe perioada congelării și decongelării. În plus se adaugă o sursă de proteine – un ser sintetic pentru a stabiliza membranele. Concentrația ridicată de crioprotectant poate fi toxică, unii crioprotectanți fiind mai toxici (propilenglicol). Mai puțin toxici sunt etilen glicol și glicerol.
Avem, deci, două categorii de materiale crioprotectante:
1.Crioprotectanți permeabili – au greutatea moleculară mică și traversează repede membrana bazală, înlocuind apa de la nivel intracelular. Exemple: etilen glicol, glicerol.
2.Crioprotectanți non-permeabili – se leagă de membrană și generează astfel un mediu extracelular hiperosmotic. Crioprotectanții extracelulari controlează rata de rehidratare în decongelare respectiv deshidratare, în congelare.
În vitrificare, moleculele extracelulare cresc vâscozitatea și stabilitatea în starea „glas like”.
În timpul decongelării, îdepărtarea rapidă a crioprotectantului determină un influx rapid de apă intracelular, ceea ce poate duce la ruperea celulei. Pentru a împiedica acest proces se folosește o soluție de sucroză, pentru a extrage crioprotectantul și a permite intrarea gradată a apei înapoi în celulă.
Pe durata conservării, celulele sunt ținute la o temperatură foarte scazută unde orice activitate metabolică încetează. În procesul de răcire cristalele de gheață formate în celulă determină un dezechilibru osmotic între mediul intra și extracelular. Șocul osmotic poate fi redus prin folosirea unui crioprotectant.
Cel mai comun crioprotectant pentru spermă este glicerolul (agent permeabil). Acesta poate fi folosit singur sau cu agent buffer. Agentul buffer previne apariția șocului osmotic și formarea cristalelor de gheață.
Cine apelează la crioprezervare
Conservarea celelor reproducătoare se poate face la cererea doritorului, dar sunt câteva situații în care este recomandată crioprezervarea:
– înaintea unor tratamente radio/chimioterapice în boli oncologice
– înaintea unor intervenții chirurgicale prostatice sau testiculare
– înainte de efectuarea vasectomiei
– înaintea expunerii cronice la radiații și materiale toxice
Metode
- metoda manuală de congelare lentă – congelare în trepte: sperma se amestecă cu crioprotectant după un anumit protocol, apoi preparatul se pune în criotuburi, întâi în frigider la 4 grade 90 minute, urmează apoi suspendarea în vapori de azot lichid 30-45 minute, apoi scufundarea rapidă în tancul de azot.
- metoda de congelare computerizată – se lucrează cu un aparat de congelare automată, cu programul de congelare a spermei.
- metoda manuală de congelare rapidă – vitrificarea: criotuburile se țin întâi în vapori de azot lichid, apoi în tancul cu azot, apoi în tancul de stocare.
Crioprezervarea spermei
Sperma crioprezervată poate fi utilizată pentru inseminarea intrauterină, spălată sau utilizată ca atare.
Specimenele normozoospermice – cele aflate în parametri normali, se prelucrează: se centrifughează în gradienți, iar peletul rezultat se crioprezervează.
Specimenele suboptime sunt centrifugate și spălate standard.
Specimene oligozoospermice nu se spală înaintea crioprezervării. Țesutul testicular și epididimal aspirat se tratează ca probele oligozoospermice.
Pentru IUI se aplică procedura de spălare, rezultând un pelet cu mobilitate care se resuspendă în mediu curat și într-un volum egal de crioprezervant de înghetare în azot lichid conform protocolului.
Crioprezervantul se adaugă picatură cu picătură pentru a evita șocul osmotic. Recipienții de crioconservare sunt reprezentați de sticlă și criovacuteinere, iar țesutul testicular conservat în criovacuteinere.
Dacă proba este pregătită prin congelare rapidă se folosește tehnica decongelării rapide, iar dacă s-a optat pentru o congelare treptată, se va decongela treptat.
Decongelarea
Poate fi făcută la temperatura camerei sau criotubul poate fi ținut în mână 5-10 minute, sau plasat în apă la 37 grade. Dacă se îndepărtează crioprezervantul, se adaugă mediu de cultură încet, apoi se centrifughează și sunt suspendate în mediu fresh. După decongelare nu se lasă mai mult de 15 minute deoarece croprezervantul este toxic pentru spermatozoizi și se poate pierde mobilitatea și viabilitatea acestora.
Stocarea
Se realizează în faza de vapori sau faza lichidă – azot lichid.
Stocarea în vapori reduce cross contaminarea. Specimenele cu risc infecțios sunt separate, deci vor exista așadar tancuri de carantină, unde se țin probele până sosesc rezultatele serologice.
Protocol pentru dezastru intern sau extern – foc, tsunami, cutremur, etc
Probele se țin în loc închis cu alarmă, cu ventilație corespunzătoare și senzor de oxigen. Când concentrația O2 scade sub o anumită limită înseamnă că un tanc elimină azot.
Vitrificarea – ovocite, embrioni, țesuturi
Deoarece zona pelucida la embrion și ovocite este poroasă și este susceptibilă la crosscontaminare cu agenti infecțioși, azotul lichid poate acumula agenti microbieni. Embrionii pot fi crioprezervați în stadiu pronuclear sau stadiul de clivaj.
În stadiul pronuclear este crucial a se evita congelarea în perioada ciclului celular când pronucleii încep să migreze în singamie, cu sinteza ADN și formarea fusului de diviziune, când microtubulii sunt foarte sensibili la schimbările de temperatură. Zigotul congelat în stadiul acesta, nu supraviețuiește.
Astfel, se practică congelarea cam la 20 – 22 de ore de la inseminare, când pronucleii sunt distincți.
Se poate practica înghețare treptată până la -30gr, apoi -100gr.
Exemplu
- embrionul spălat se amestecă cu propanediol la temperatura camerei, iar în pasul 2 se amestecă cu soluție de sucroza 0,1 M
- se încarcă în criotuburi.
- se răcește cu 2 gr/minut până la -7gr, se menține puțin la temperatura aceasta pentru echilibrare termică și pentru începutul formării acelor de gheață.
- se introduce rapid în azot lichid.
Protocolul de încălzire – se ține proba cam 40 de secunde la temperatura camerei, apoi se introduce în baie de apă la 40grade, pentru câteva minute. Se îndepărtează crioprotectantul prin amestec cu soluție de sucroză, apoi urmează spălarea de 3 ori în mediu de spălare. Se plasează în placă la temperatura camerei inițial, iar apoi în termostat la 37 grade.
Protocolul de vitrificare
Se efectuează o amestecare graduală cu o soluție de echilibrare izotonică la temperatura camerei, iar apoi se realizează imersia în soluția de vitrificare.
Exemplu protocol blastocist: Embrionul se pipeteaza în soluție izotonică, pe rând în cele 3 soluții de vitrificare V1V2V3, iar apoi în nitrogenul lichid. Poate sa apară eșecul de recuperare al embrionului sau al ovocitului, mai ales când este pregătit de alt laborator sau când embrionul nu poate fi identificat la încălzire, deoarece el e dificil de vizualizat în soluție de sucroză pentru că devine translucid.
În cazul congelării blastocistului există riscul de colapsare a blastocilului după încălzire. Înaintea expunerii la crioprotectant se efectuează o puncție în trofoderm cu un microac pentru a permite pătrunderea crioprotectantului.
Considerente etice
Trebuie să existe un protocol pentru congelarea embrionilor, cu acordul scris parental, care să cuprindă date despre timpul de congelare (1an, 2 ani) și ce se întâmplă cu ei după acest timp, pentru că în SUA de pildă sunt 500.000 de embrioni congelați abandonați.